همسانه سازی و بررسی امکان انتقال ژن آنتی ژن سطحی هپاتیت بی به گیاه گوجه فرنگی

عفونت حاصل از ویروس هپاتیت بی(hbv) یک مشکل جهانی است. طبق ارزیابی های انجام شده ، حدود 350 میلیون حامل مزمن hbv در جهان وجود دارد که حدود 5% از جمعیت کل جهان را تشکیل می دهند. واکسن هپاتیت بی بدست آمده از مخمر و سلولهای پستانداران گران است و استفاده از آن را در کشورهای در حال توسعه محدود می کند. با توجه به اینکه بیوراکتورهای گیاهی به عنوان سیستم های موفق و اقتصادی در تولید پروتئین های نو ترکیب شناخته شده اند به نظر می رسد که تولید این واکسن با استفاده از سیستم بیانی گیاه می تواند راهگشایی برای حل این مسئله باشد. در این پژوهش آغازگرهای مناسب با توجه به توالی های افزایش دهند? بیان گیاهی، توالی های دو طرف ژن آنتی ژن سطحی هپاتیت بی و محل های برش مناسب طراحی و ژن موردنظر در ناقل pcambia 1304 تحت کنترل پیش بر camv 35s و خاتمه دهنده nos ، همسانه سازی شد. ساز? بدست آمده به باکتری اشرشیاکولای سوی? dh5? به کمک روش شوک حرارتی منتقل شد و کلونیها بر روی محیط کانامایسین 50 میکروگرم در میلی لیتر انتخاب شدند. با استفاده از تکنیکهای مختلف colony pcr ، هضم آنزیمی و توالی یابی ، همسانه سازی ژن آنتی ژن سطحی هپاتیت بی در ناقل pcambia1304 تأیید شد. سپس سازه مورد نظر با روش استاندارد انجماد و ذوب به باکتری اگروباکتریوم سویه lba4404 منتقل شده و برای تراریخت کردن گیاه گوجه فرنگی از طریق ریزنمونه های کوتیلدونی و به روش دیسک برگی مورد استفاده قرار گرفت. به منظور تلقیح در ابتدا ریزنمونه ها به مدت 48 ساعت بر روی محیط پیش کشت قرار گرفته، سپس مایه زنی با اگروباکتریوم انجام شده و ریزنمونه ها به مدت 48 ساعت در تاریکی و دمای 28 درجه بر روی محیط هم کشت قرار گرفتند. در نهایت ریزنمونه های تلقیح شده به محیط کشت انتخابی که شامل محیط هم کشتی به همراه آنتی بیوتیک های سفوتاکسیم 250 میلی گرم در لیتر و هیگرومایسین 5/7 میلی گرم در لیتر منتقل شدند و در شرایط 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی در اتاق رشد قرار گرفتند. از گیاهان باززایی شده تراریخت و شاهد به منظور آنالیز گیاهان تراریخت استخراج dna صورت گرفت و از آن به عنوان الگو در واکنش pcr استفاده شد. حضور ژن آنتی ژن سطحی هپاتیت بی در گیاه تراریخت و عدم حضور آن در گیاه شاهد مورد تاًیید قرار گرفت. این اولین گزارش از انتقال ژن آنتی ژن سطحی هپاتیت بی به گیاه گوجه فرنگی در ایران است.